探究红花草莓花色苷积累机制，加快选育新花色品种

hua818

花青素生物合成是植物类黄酮合成途径的一个分支，受多种结构基因（包括PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS等）调控。 。花青素的生物合成已在模型植物中得到了明确的研究。其合成和代谢在转录水平上受MYB-bHLH-WD40复合物的调节。大多数参与花青素合成的MYB转录因子促进花青素合成结构基因的合成。表达，增加花青素合成。红花草莓的花瓣呈不同程度的红色，与普通栽培草莓的白色花瓣不同。其花大、花期长，兼有观赏和食用价值。红花草莓新品种的选育多以传统杂交育种为主，费时费力。研究红花草莓花色苷积累机制对于加快红花草莓新品种选育具有重要意义。

1、材料准备

实验中使用的红花草莓品种为“Berry Red”，白花草莓品种为“”。花芽大小为4毫米（花瓣未着色）记为S1，第二天记为S2，以此类推，直至花瓣完全展开，记为S7。使用七个不同发育阶段（S1 ~ S7）的花瓣作为研究材料。

2 总花色苷含量的测定

取S1～S7各花瓣0.10 g，用液氮研磨成粉末，转移至10 mL离心管中，加入5 mL 1%盐酸甲醇溶液（1:99，体积比），摇匀混匀，并置于 4°C。冰箱避光充分提取24小时（期间摇匀数次），然后离心15分钟（4℃，13 000 r·min-1）。使用紫外可见分光光度计测量上清液中的 A530 和 A657。

3、花青素合成相关基因的筛选

从 4 个阶段（S1、S2、S3 和 S6，每个阶段 3 个生物重复）采集“Berry Red”草莓花瓣样本。提取样品总RNA后，去除rRNA，富集mRNA，反转录形成双链cDNA。 ，修复cDNA配对末端，添加，进行PCR扩增，构建上机文库。使用XP Beads筛选200bp左右的cDNA，进行PCR扩增，再次使用XP Beads纯化PCR产物。最后获得文库并通过质量控制分析。基于八倍体草莓参考基因组，使用该软件对转录本进行比较和分析。然后使用该软件计算每个花瓣阶段（FPKM）中每个基因的表达量。利用软件进行差异基因分析，结合KEGG、Nr、Pfam等数据库注释，鉴定筛选‘莓红’草莓花瓣发育过程中与花青素含量相关的花青素生物合成结构基因。根据系数(r)，对差异表达的R2R3-MYB与花青素含量及花青素生物合成结构基因表达量进行相关性分析，筛选出调节‘树莓红’草莓花瓣中花青素合成的R2R3-MYB转录因子基因出去。

4. qRT-PCR 分析

该试剂盒用于从不同发育阶段（S1、S2、S3和S6）的花瓣中提取RNA，每个阶段重复3次，总共12个样品。使用天根gDNA RT试剂盒进行逆转录。使用Oligo 7设计引物作为内参基因。使用2×Easy Taq® PCR（+染料）试剂盒进行PCR反应并鉴定引物特异性。 PCR反应程序为：94℃5min； 94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟35个循环； 72°C 10 分钟。以12份样品的cDNA为模板，使用天根真色（SYBR Green）荧光定量试剂盒进行目的基因qRT-PCR反应，反应体系为20 μL。反应程序为：95℃15min； 95°C 10 秒，60°C 20 秒，40 个循环。每个样品重复三次。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

5. 实验结果

(1)不同发育阶段花瓣花青素含量

‘莓红’草莓花瓣中总花色苷含量总体呈现先增加后减少的趋势。 S1期花瓣总花色苷含量基本为0； S6时期最高，是S1时期的94.07倍； S7时期大幅下降，低于S6时期。 41.33%。这说明‘树莓红’草莓花瓣中的花青素含量在花瓣处于半展开状态时不断积累。当花瓣完全展开时，花青素降解，含量减少。而白花草莓‘蒙特雷’在不同发育阶段的花瓣中几乎没有检测到花青素，说明‘蒙特雷’草莓花瓣发育期间没有明显的花青素积累。

(2)花青素合成结构基因的鉴定及表达分析

选择花青素含量显着变化时期（S1、S2、S3和S6）的花瓣进行转录组数据库构建。基于KEGG注释结果，鉴定出110个与花青素合成途径（包括修饰和转运）相关的差异表达结构基因。筛选出低表达丰度（FPKM）基因后，共获得68个花青素合成相关结构基因，包括5个PAL、4个C4H、12个4CL、4个CHS、7个CHI、4个F3H、4个DFR、3个ANS、 3 3GT、1 3,5GT 和 21 GST。这些基因在上述四个时期有不同的表达趋势。大多数结构基因随着花瓣发育和花色加深表达量增加，如FaPAL、FaC4H、Fa4CL、FaCHS、FaF3H、FaANS和Fa3GT等；少数结构基因的表达随着花色加深而降低，如3,5GT和GST基因的一些成员。这说明‘莓红’草莓在花瓣发育过程中，花青素合成相关结构基因的上调表达，导致大量花青素的合成和积累，导致花瓣逐渐变红、颜色加深。 。

(3)花青素合成相关差异基因的qPCR分析

基于基因表达量（FPKM>10）及其与花青素含量的相关性（|r|>0.85），3个R2R3-MYB基因（、和）和9个差异结构基因（FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaF3H-） 1、FaF3H-2、FaDFR、FaANS、Fa3GT 和 Fa3,5GT）。 qRT-PCR分析发现这些基因的相对表达变化与转录组中基因表达(FPKM)的变化一致。其中FaPAL、Fa4CL-1、Fa4CL-2、FaDFR、Fa3GT，花瓣由白色变为红色。在发育过程中（S1~S6），相对表达量逐渐升高，且S6期相对表达量显着高于S1期。

FaF3H-1、FaF3H-2、FaANS和Fa3,5GT基因的相对表达量均呈先升高后降低的趋势，其中S3显着高于其他3个发育阶段；相对表达量变化趋势与花色苷含量变化趋势相反，随着花瓣颜色加深，相对表达量逐渐降低。这说明‘浆果红’花瓣变色前后，大部分结构基因均上调，可能对花青素的积累起到正向调节作用，也可能起到负向调节作用。

本研究发现Fa4CL、FaDFR和Fa3GT基因与花青素含量呈极显着正相关，两个R2R3-MYB转录因子基因（即、和）与花青素含量呈极显着正相关。发现了参与红草莓花青素生物合成的结构基因（如4CL、F3H、DFR、ANS和3GT等），并且这些基因均具有两个以上的成员。不同基因成员的表达模式并不完全一致，这表明‘莓红’草莓花瓣中花青素合成的每一步都可能受到多个基因的调控。由于“莓红”草莓花瓣中的花青素是从无到有，我们重点研究了不同发育阶段与花青素合成相关的差异基因。共筛选出110个与花青素合成途径相关的差异结构基因（包括与花青素修饰和运输相关的基因），可以发现大多数结构基因的表达量在花发育过程中持续增加，表明在花瓣发育过程中‘覆盆子红’草莓发育过程中，与花青素合成相关的结构基因表达上调，使得花青素能够大量合成和积累。